챕터 22 본편: 변이 찾기

23 분 소요

변이 찾기 실습

개요

이 장에서는 BAM 파일로부터 유전 변이를 찾는 실습을 다룬다. 변이 찾기(Variant Calling)의 이론적 배경과 VCF 파일 형식에 대한 내용은 4장 변이와 진화를 참조한다.

실습 환경 구성

작업 디렉토리 생성

$ mkdir -p ~/week5
$ cd ~/week5

Octopus 설치

conda를 사용하여 Octopus를 설치한다.

$ conda activate bioinfo
$ conda install octopus

Octopus는 최근 벤치마크에서 높은 성능을 보이는 variant caller로, local realignment 기능을 내장하고 있어 indel 주변에서의 정확한 변이 탐지가 가능하다.

입력 파일 준비

심볼릭 링크 생성

이전 실습에서 생성한 파일들을 week5 디렉토리로 심볼릭 링크한다.

$ ln -s ../week4/reference.fa.gz .
$ ln -s ../week4/aligned.sorted.markdup.bam .
$ ln -s ../week4/aligned.sorted.markdup.bam.bai .

참조 유전체 준비

Octopus는 압축 해제된 참조 유전체와 faidx 파일을 필요로 한다.

$ zcat reference.fa.gz > reference.fa
$ samtools faidx reference.fa

faidx 명령은 참조 유전체의 인덱스 파일(.fai)을 생성한다. 이 인덱스는 특정 유전체 영역에 빠르게 접근할 수 있게 해준다.

Octopus를 이용한 변이 찾기

기본 실행

다음 명령어로 variant calling을 수행한다.

$ octopus -R reference.fa -I aligned.sorted.markdup.bam -o variants.vcf.gz

주요 옵션 설명:

옵션	설명
-R	참조 유전체 파일
-I	입력 BAM 파일
-o	출력 VCF 파일

실행 시간은 데이터 크기에 따라 다르며, 예제 데이터의 경우 약 4분이 소요된다.

멀티스레드 실행

대용량 데이터의 경우 스레드 수를 지정하여 속도를 높일 수 있다.

$ octopus -R reference.fa -I aligned.sorted.markdup.bam -o variants.vcf.gz --threads 8

VCF 파일 확인

파일 내용 확인

생성된 VCF 파일의 내용을 확인한다.

$ zcat variants.vcf.gz | less

VCF 파일은 헤더(##로 시작)와 본문(#CHROM으로 시작하는 컬럼 헤더 이후)으로 구성된다.

VCF 필드 이해

VCF 파일의 주요 필드는 다음과 같다:

필드	설명
CHROM	염색체 번호
POS	유전체 상의 위치 (1-based)
ID	dbSNP ID (있는 경우)
REF	참조 유전체의 염기
ALT	변이된 염기
QUAL	변이 호출 품질 점수
FILTER	필터 상태 (PASS 또는 필터 실패 이유)
INFO	변이에 대한 추가 정보
FORMAT	샘플별 데이터 형식

VCF 형식에 대한 자세한 내용은 4장 변이와 진화를 참조한다.

변이 유형 구분

REF와 ALT 필드를 비교하여 변이 유형을 판단할 수 있다:

SNV (Single Nucleotide Variant): REF와 ALT의 길이가 같은 경우 (예: A → T)
Insertion: ALT가 REF보다 긴 경우 (예: T → TGGA)
Deletion: REF가 ALT보다 긴 경우 (예: TGG → T)
MNV (Multiallelic Nucleotide Variant): ALT에 쉼표로 구분된 여러 대립유전자가 있는 경우

ANNOVAR를 이용한 변이 주석

ANNOVAR 다운로드

ANNOVAR는 변이에 대한 기능적 주석을 추가하는 도구이다. ANNOVAR는 학술 목적으로 무료로 사용할 수 있으며, 다운로드를 위해서는 사용자 등록이 필요하다.

https://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/user-guide/download/ 페이지에 접속한다.
페이지 하단의 등록 양식을 작성한다 (이름, 이메일, 소속 기관 등).
등록 후 이메일로 다운로드 링크를 받는다.
다운로드한 파일을 week5 디렉토리에 압축 해제한다.

$ tar -xvzf annovar.latest.tar.gz

압축 해제 후 annovar 디렉토리가 생성된다.

ANNOVAR 실행 환경 설정

ANNOVAR 실행에 필요한 Perl 모듈을 설치한다.

$ conda install perl-pod-usage

예제 파일 준비

ANNOVAR 예제 파일을 심볼릭 링크한다.

$ ln -s annovar/example/ex2.vcf .

ANNOVAR 실행

table_annovar.pl을 사용하여 변이 주석을 수행한다.

$ annovar/table_annovar.pl ex2.vcf annovar/humandb \
    -buildver hg19 \
    -out myanno \
    -remove \
    -protocol refGene,cytoBand,exac03,avsnp147,dbnsfp30a \
    -operation g,r,f,f,f \
    -nastring . \
    -vcfinput \
    -polish

ANNOVAR 옵션 설명

주요 옵션:

옵션	설명
-buildver	참조 유전체 버전 (hg19, hg38 등)
-out	출력 파일 접두사
-protocol	사용할 데이터베이스 목록
-operation	각 프로토콜의 작업 유형
-vcfinput	VCF 형식 입력 사용

operation 유형:

유형	설명
g (Gene-based)	변이 위치(Exonic, Intronic, UTR)와 아미노산 변화 분석
r (Region-based)	알려진 유전체 영역(TF binding sites, 반복 영역 등)과의 중첩 확인
f (Filter-based)	데이터베이스(dbSNP, gnomAD 등)에서 계산된 점수 참조

결과 확인

주석이 추가된 VCF 파일을 확인한다.

$ less myanno.hg19_multianno.vcf

유전변이 데이터베이스

주요 데이터베이스

변이 분석에 활용되는 주요 데이터베이스:

데이터베이스	설명
dbSNP	NCBI의 단일염기다형성 데이터베이스
gnomAD	대규모 인구 집단의 변이 빈도 데이터베이스
1000 Genomes	전 세계 인구 집단의 유전 변이 데이터베이스
OMIM	인간 유전자와 유전 질환 카탈로그
COSMIC	암 체세포 돌연변이 카탈로그

Blacklist 영역

중복 영역이나 반복 서열 등 분석에서 제외해야 하는 영역을 blacklist로 관리한다. 이러한 영역에서 발견된 변이는 허위 양성(false positive)일 가능성이 높다.

분석 파이프라인 개요

개인/약물 유전체 분석

개인 유전체나 약물 유전체 분석의 전형적인 파이프라인:

Illumina Sequencer → BCL 파일
bcl2fastq → FASTQ 파일
FastQC → 품질 관리
Cutadapt → 어댑터 제거
BWA-MEM2 → BAM 파일
Octopus 등 → VCF 파일
dbSNP, OMIM 등 → 변이 주석

질병 유전체 분석

종양-정상 쌍 분석의 경우 체세포 변이(somatic variant)를 찾기 위해 종양 샘플과 정상 샘플(주로 혈액)을 함께 분석한다. 이후 GSEA, KEGG, COSMIC 등의 데이터베이스를 활용하여 기능 분석을 수행한다.

실습 과제

실습 22.1: Octopus 실행

week5 디렉토리를 생성하고 필요한 파일들을 심볼릭 링크한다.
참조 유전체를 압축 해제하고 faidx 인덱스를 생성한다.
Octopus로 variant calling을 수행한다.
생성된 VCF 파일의 내용을 확인한다.

실습 22.2: VCF 파일 해석

다음 변이의 의미를 설명하시오:

CHROM=3, POS=23, REF=A, ALT=T
CHROM=5, POS=53, REF=T, ALT=TGGA
CHROM=4, POS=4, REF=TGG, ALT=T

실습 22.3: ANNOVAR 실행

ANNOVAR를 설정하고 예제 파일을 준비한다.
table_annovar.pl을 실행하여 변이 주석을 수행한다.
출력된 multianno.vcf 파일의 INFO 필드에 추가된 주석을 확인한다.

출처

이 본편 글은 원본 docx에 기록된 아래 출처를 기준으로 게시했습니다.

원본 문서: https://chaek.org/books/introduction-to-biomedical-informatics
원본 저장소: https://github.com/chaek-union/introduction-to-biomedical-informatics
원본 파일: practices/22-variant-calling.md

Gemini AI 채점

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API KEY 미등록

1. [쉬움] 객관식
다음 명령어의 목적으로 옳은 것을 고르시오.
```
mkdir -p ~/week5
cd ~/week5
```
선택지 `week5` 작업 디렉토리를 만들고 해당 디렉토리로 이동한다. Octopus를 설치하고 활성화한다. VCF 파일의 헤더를 제거한다. ANNOVAR 결과 파일을 압축한다.
2. [쉬움] 객관식
다음 명령어의 역할로 옳은 것을 고르시오.
```
ln -s ../week4/reference.fa.gz .
```
선택지 참조 유전체 압축 파일을 삭제한다. 참조 유전체를 VCF로 변환한다. 이전 실습의 `reference.fa.gz` 파일을 현재 디렉토리에 심볼릭 링크한다. `reference.fa.gz` 파일의 faidx 인덱스를 생성한다.
3. [쉬움] 객관식

Octopus 실행 전에 압축된 참조 유전체를 해제하고 faidx 인덱스를 생성하는 명령어 조합으로 옳은 것을 고르시오.

선택지 `less reference.fa.gz` 후 `octopus --index reference.fa` `tar -xvzf reference.fa.gz` 후 `conda install faidx` `bcl2fastq reference.fa.gz` 후 `samtools view reference.fa` `zcat reference.fa.gz > reference.fa` 후 `samtools faidx reference.fa`
4. [쉬움] 객관식

Octopus 설치를 위해 본문에서 제시된 명령어로 옳은 것을 고르시오.

선택지 `pip install octopus` `conda activate bioinfo` 후 `conda install octopus` `uv pip install octopus` `samtools install octopus`
5. [보통] 객관식
다음 명령어에서 -R 옵션이 의미하는 것으로 옳은 것을 고르시오.
```
octopus -R reference.fa -I aligned.sorted.markdup.bam -o variants.vcf.gz
```
선택지 참조 유전체 파일을 지정한다. 입력 BAM 파일을 지정한다. 출력 VCF 파일을 지정한다. 사용할 스레드 수를 지정한다.
6. [보통] 객관식

대용량 데이터에서 Octopus 실행 속도를 높이기 위해 본문에서 사용한 옵션으로 옳은 것을 고르시오.

선택지 `--genomeDir star_index` `--vcfinput` `--quantMode GeneCounts` `--threads 8`
7. [보통] 객관식
다음 VCF 변이의 유형으로 옳은 것을 고르시오.
```
REF=T
ALT=TGGA
```
선택지 Deletion Insertion MNV FILTER 실패
8. [보통] 객관식
다음 VCF 필드 설명으로 옳은 것을 고르시오.
```
CHROM=3, POS=23, REF=A, ALT=T
```
선택지 23번 염색체의 3번 위치에서 A가 T로 바뀐 변이이다. 3번 염색체의 23번 위치에서 T가 A로 바뀐 변이이다. 3번 염색체의 23번 위치에서 참조 염기 A가 대체 염기 T로 바뀐 변이이다. 3번 염색체의 23번 위치에 T가 삽입된 변이이다.
9. [보통] 객관식

VCF 파일의 FILTER 필드가 나타내는 의미로 옳은 것을 고르시오.

선택지 참조 유전체의 염기 서열이다. 변이 호출이 필터를 통과했는지 또는 실패했다면 그 이유를 나타낸다. 샘플별 데이터 형식을 지정한다. 변이의 dbSNP ID만 저장한다.
10. [보통] 객관식
다음 ANNOVAR 명령어 일부에서 -vcfinput 옵션의 의미로 옳은 것을 고르시오.
```
annovar/table_annovar.pl ex2.vcf annovar/humandb \
    -buildver hg19 \
    -out myanno \
    -vcfinput
```
선택지 출력 파일을 압축한다. 참조 유전체 버전을 hg38로 바꾼다. 모든 주석 데이터베이스를 삭제한다. VCF 형식 입력을 사용한다.
11. [어려움] 객관식

ANNOVAR의 -operation 유형 중 g (Gene-based)의 설명으로 옳은 것을 고르시오.

선택지 변이 위치와 아미노산 변화처럼 유전자 기준 주석을 수행한다. VCF 파일을 BAM 파일로 변환한다. 반복 영역과 겹치는지 확인하지 않고 모든 변이를 삭제한다. 여러 샘플의 FASTQ 품질을 비교한다.
12. [어려움] 객관식

다음 데이터베이스 설명으로 옳은 것을 고르시오.

선택지 OMIM은 대규모 인구 집단의 변이 빈도를 저장하는 데이터베이스이다. gnomAD는 인간 유전자와 유전 질환 카탈로그이다. COSMIC은 암 체세포 돌연변이 카탈로그이다. dbSNP는 세포 유형별 발현 시그니처 행렬이다.
13. [어려움] 객관식

blacklist 영역에서 발견된 변이를 해석할 때 특히 주의해야 하는 이유로 가장 적절한 것을 고르시오.

선택지 blacklist 영역은 반드시 단백질 코딩 유전자만 포함하기 때문이다. blacklist 영역에서는 모든 변이가 생식세포 변이로 확정되기 때문이다. blacklist 영역은 항상 dbSNP ID가 없기 때문이다. 중복 영역이나 반복 서열 등으로 인해 허위 양성 가능성이 높기 때문이다.
14. [어려움] 객관식

개인/약물 유전체 분석 파이프라인의 순서로 옳은 것을 고르시오.

선택지 FASTQ → BCL → BAM → VCF → FastQC → 변이 주석 Illumina Sequencer → BCL → FASTQ → FastQC → Cutadapt → BWA-MEM2 → BAM → Octopus 등 → VCF → 변이 주석 VCF → BCL → FASTQ → BAM → Cutadapt → 변이 주석 BAM → FastQC → BCL → FASTQ → VCF → 변이 주석
15. [어려움] 객관식

종양-정상 쌍 분석에서 정상 샘플을 함께 분석하는 목적에 가장 가까운 것은 무엇인가?

선택지 정상 샘플을 이용해 STAR 인덱스를 생성하기 위해서이다. 정상 샘플의 모든 변이를 암 변이로 분류하기 위해서이다. 종양 샘플에서 체세포 변이를 찾기 위해 비교 기준으로 사용하기 위해서이다. 변이 주석을 생략하고 FASTQ 품질만 확인하기 위해서이다.
16. [어려움] 객관식

다음 중 VCF 변이 유형 판정으로 옳은 것을 고르시오.

선택지 `REF=TGG, ALT=T`는 deletion이다. `REF=A, ALT=T`는 insertion이다. `REF=T, ALT=TGGA`는 deletion이다. ALT에 쉼표로 여러 대립유전자가 있으면 항상 SNV 하나로만 해석한다.
주관식 1. [쉬움] 주관식 · Gemini 채점

현재 디렉토리에서 variants.vcf.gz 파일의 내용을 확인하는 명령어를 작성하시오.
주관식 2. [보통] 주관식 · Gemini 채점
다음 조건을 만족하는 Octopus 명령어를 작성하시오.
- 참조 유전체 파일: reference.fa
- 입력 BAM 파일: aligned.sorted.markdup.bam
- 출력 VCF 파일: variants.vcf.gz
주관식 3. [보통] 주관식 · Gemini 채점
Octopus를 멀티스레드로 실행하시오. 조건은 다음과 같다.
- 참조 유전체 파일: reference.fa
- 입력 BAM 파일: aligned.sorted.markdup.bam
- 출력 VCF 파일: variants.vcf.gz
- 스레드 수: 8
주관식 4. [보통] 주관식 · Gemini 채점
다음 VCF 필드 조합이 의미하는 변이 유형을 각각 작성하시오.
```
A. REF=A, ALT=T
B. REF=TGG, ALT=T
C. REF=T, ALT=TGGA
D. ALT에 쉼표로 구분된 여러 대립유전자가 있음
```
주관식 5. [보통] 주관식 · Gemini 채점

VCF의 CHROM, POS, REF, ALT, QUAL, FILTER 필드가 각각 무엇을 의미하는지 간단히 설명하시오.
주관식 6. [어려움] 주관식 · Gemini 채점
다음 조건을 만족하는 ANNOVAR 실행 명령어를 작성하시오.
- 입력 파일: ex2.vcf
- humandb 경로: annovar/humandb
- 참조 유전체 버전: hg19
- 출력 접두사: myanno
- protocol: refGene,cytoBand,exac03,avsnp147,dbnsfp30a
- operation: g,r,f,f,f
- -remove, -nastring ., -vcfinput, -polish 옵션을 포함할 것
주관식 7. [어려움] 주관식 · Gemini 채점

ANNOVAR의 g, r, f operation 유형을 각각 설명하시오.
주관식 8. [어려움] 주관식 · Gemini 채점

개인/약물 유전체 분석 파이프라인을 입력 데이터 생성부터 변이 주석까지 순서대로 서술하시오.