챕터 19 본편: NGS 시퀀싱과 Fastq 파일 처리

12 분 소요

NGS 시퀀싱 데이터 처리 실습

개요

이 장에서는 차세대 시퀀싱(NGS) 데이터의 실제 처리 방법을 다룬다. NGS 기술의 원리와 Fastq 파일 형식에 대한 이론적 내용은 3장 차세대 시퀀싱을 참조한다.

실습 환경 구성

conda를 사용하여 실습에 필요한 도구들을 설치한다.

$ conda create -n bioinfo
$ conda activate bioinfo
$ conda install fastqc cutadapt

Fastq 파일 확인

압축 파일 내용 확인

Fastq 파일은 일반적으로 gzip으로 압축되어 .fastq.gz 형태로 제공된다. zcat과 less 명령을 사용하여 압축된 상태로 내용을 확인할 수 있다.

$ zcat R1.fastq.gz | less

Fastq 파일의 구조와 각 필드의 의미는 3장 Fastq 파일 형식과 구조를 참조한다.

Paired-end 파일

Paired-end 시퀀싱의 경우 두 개의 Fastq 파일이 생성된다. 파일명에 R1과 R2로 구분되며, 각각 Read 1과 Read 2를 포함한다.

Liver_SeqScope_2nd_1_R1.fastq.gz
Liver_SeqScope_2nd_1_R2.fastq.gz

두 파일의 줄 수는 동일하며, 같은 위치의 read는 동일한 DNA 조각에서 유래한 짝이다.

FastQC를 이용한 품질 확인

FastQC는 Fastq 파일의 품질을 확인하는 도구이다. 다음과 같은 정보를 제공한다.

위치별 품질 점수 분포
서열 품질 점수 분포
위치별 염기 조성
GC 함량 분포
서열 길이 분포
중복 서열 수준
과다 표현 서열
어댑터 오염도

FastQC 실행

단일 파일 실행:

$ fastqc R1.fastq.gz

Paired-end 파일 동시 실행:

$ fastqc R1.fastq.gz R2.fastq.gz

for 루프를 사용한 여러 파일 처리:

$ for i in `seq 1 2`; do fastqc R${i}.fastq.gz; done

결과 확인

FastQC 실행이 완료되면 HTML 형식의 보고서가 생성된다. 웹 브라우저에서 열어 품질을 확인한다.

주요 확인 항목:

Per base sequence quality: 각 위치별 품질 점수 분포. 일반적으로 read 끝으로 갈수록 품질이 낮아진다.
Per sequence quality scores: 전체 read의 평균 품질 분포.
Adapter Content: 어댑터 서열 오염도. 높은 비율이 나타나면 트리밍이 필요하다.

Cutadapt를 이용한 전처리

Cutadapt는 어댑터 서열 제거와 품질 기반 트리밍을 수행하는 도구이다.

어댑터 오염

어댑터 오염은 DNA insert가 read 길이보다 짧을 때 발생한다. 시퀀싱이 insert를 지나 반대쪽 어댑터 서열까지 읽어버리기 때문이다. 이러한 어댑터 서열은 분석 전에 반드시 제거해야 한다.

Illumina Universal Adapter 서열은 AGATCGGAAGAG로 시작한다. 사용하는 시퀀싱 키트에 따라 전체 어댑터 서열이 다를 수 있으므로, 정확한 서열은 Illumina Adapter Sequences 문서를 참조한다.

Cutadapt는 어댑터 서열 외에도 poly-A tail을 제거하는 데 사용할 수 있다. RNA-seq 데이터에서 poly-A tail이 포함된 경우 -a “A{100}” 옵션으로 제거할 수 있다.

Cutadapt 옵션

주요 옵션:

옵션	설명
-a	Read 1에서 제거할 3’ 어댑터 서열
-A	Read 2에서 제거할 3’ 어댑터 서열
-o	Read 1 출력 파일
-p	Read 2 출력 파일
-q	품질 기반 트리밍 임계값

어댑터 제거 실행

Paired-end 파일에서 어댑터 제거:

$ cutadapt -a AGATCGGAAGAG -A AGATCGGAAGAG -o trimmed_R1.fastq.gz -p trimmed_R2.fastq.gz R1.fastq.gz R2.fastq.gz

품질 기반 트리밍을 함께 수행하는 경우:

$ cutadapt -a AGATCGGAAGAG -A AGATCGGAAGAG -q 20 -o trimmed_R1.fastq.gz -p trimmed_R2.fastq.gz R1.fastq.gz R2.fastq.gz

결과 확인

처리 후 FastQC를 다시 실행하여 어댑터가 제거되었는지 확인한다.

$ fastqc trimmed_R1.fastq.gz trimmed_R2.fastq.gz

실습 과제

실습 19.1: Fastq 파일 구조 확인

제공된 Fastq 파일을 zcat과 less를 사용하여 확인한다.
첫 번째 read의 각 줄이 무엇을 의미하는지 설명한다.
품질 점수 문자를 Phred 점수로 변환한다.

실습 19.2: FastQC 분석

R1.fastq.gz와 R2.fastq.gz에 대해 FastQC를 실행한다.
생성된 HTML 보고서를 확인한다.
어댑터 오염이 있는지 확인한다.

실습 19.3: 어댑터 제거

Cutadapt를 사용하여 어댑터를 제거한다.
처리 전후의 FastQC 결과를 비교한다.
어댑터 제거 효과를 확인한다.

출처

이 본편 글은 원본 docx에 기록된 아래 출처를 기준으로 게시했습니다.

원본 문서: https://chaek.org/books/introduction-to-biomedical-informatics
원본 저장소: https://github.com/chaek-union/introduction-to-biomedical-informatics
원본 파일: practices/19-ngs-fastq.md

Gemini AI 채점

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1. [쉬움] 객관식

실습 환경 구성을 위해 본편에 제시된 명령어 순서로 옳은 것을 고르시오.

선택지 fastqc R1.fastq.gz → conda create -n bioinfo → cutadapt -q 20 conda create -n bioinfo → conda activate bioinfo → conda install fastqc cutadapt bwa-mem2 index hg38.fa → conda activate bioinfo → zcat R1.fastq.gz samtools sort → samtools index → conda install fastqc cutadapt
2. [쉬움] 객관식

압축된 Fastq 파일의 내용을 확인하는 명령어로 옳은 것을 고르시오.

선택지 samtools view R1.fastq.gz | less bwa-mem2 mem R1.fastq.gz | less zcat R1.fastq.gz | less cutadapt R1.fastq.gz | less
3. [쉬움] 객관식

Paired-end Fastq 파일에 대한 설명으로 옳은 것을 고르시오.

선택지 R1과 R2 파일은 각각 Read 1과 Read 2를 포함하며, 같은 위치의 read는 동일한 DNA 조각에서 유래한 짝이다. Paired-end 시퀀싱에서는 항상 하나의 파일만 생성된다. R1 파일의 줄 수는 R2 파일보다 항상 4배 많아야 한다. R2 파일은 FastQC 실행 전에 반드시 삭제해야 한다.
4. [쉬움] 객관식

FastQC가 제공하는 정보로 옳은 것을 고르시오.

선택지 유전체 데이터 접근 위원회의 승인 결과 신약 개발 단계별 비용 계산표 단백질 구조의 X선 회절 패턴 위치별 품질 점수, 염기 조성, GC 함량, 서열 길이 분포, 중복 수준, 어댑터 오염도 등
5. [보통] 객관식

FastQC 보고서의 Per base sequence quality 항목에 대한 설명으로 옳은 것을 고르시오.

선택지 참조 유전체 인덱스 파일 목록을 보여준다. 각 위치별 품질 점수 분포를 보여주며, 일반적으로 read 끝으로 갈수록 품질이 낮아질 수 있다. Read Group의 ID와 SM 필드를 자동 수정한다. 유전체 데이터 접근 권한 승인 여부를 보여준다.
6. [보통] 객관식

FastQC 보고서에서 Adapter Content가 높게 나타났을 때 적절한 후속 조치로 옳은 것을 고르시오.

선택지 Cutadapt로 어댑터 서열을 제거한 뒤 FastQC를 다시 실행해 개선 여부를 확인한다. 참조 유전체를 삭제한다. SAM 파일의 FLAG 값을 99로 고정한다. BWA-MEM2 인덱스 파일을 모두 압축한다.
7. [보통] 객관식

어댑터 오염이 발생하는 상황으로 옳은 것을 고르시오.

선택지 참조 유전체 인덱스를 만들지 않았을 때 발생한다. SAM 파일을 BAM으로 변환할 때 자동으로 발생한다. DNA insert가 read 길이보다 짧아 시퀀싱이 반대쪽 어댑터 서열까지 읽을 때 발생한다. DICOM 파일에 장비 정보가 포함될 때 발생한다.
8. [보통] 객관식

Cutadapt 옵션에 대한 설명으로 옳은 것을 고르시오.

선택지 `-a`는 참조 유전체, `-A`는 스레드 수, `-o`는 FASTQC HTML 파일이다. `-q`는 Read Group 식별자, `-p`는 시퀀싱 플랫폼이다. `-A`는 압축 해제, `-o`는 표준 에러 저장, `-p`는 파이프 생성을 의미한다. `-a`는 Read 1의 3' 어댑터, `-A`는 Read 2의 3' 어댑터, `-o`는 Read 1 출력, `-p`는 Read 2 출력을 의미한다.
9. [어려움] 객관식

RNA-seq 데이터에서 poly-A tail을 제거하기 위해 본편에 언급된 Cutadapt 옵션으로 옳은 것을 고르시오.

선택지 -a "A{100}" -R '@RG\tID:sample1' -F 4 -t 8
10. [어려움] 객관식

품질 기반 트리밍 임계값 20을 Cutadapt에 함께 적용하는 옵션으로 옳은 것을 고르시오.

선택지 -R 20 -q 20 -F 20 -p 20만 단독 사용
11. [어려움] 객관식

어댑터 제거 후 확인 절차로 옳은 것을 고르시오.

선택지 samtools flagstat R1.fastq.gz R2.fastq.gz를 실행한다. bwa-mem2 index trimmed_R1.fastq.gz를 실행한다. grep -E '^chr' trimmed_R1.fastq.gz만 실행하면 충분하다. fastqc trimmed_R1.fastq.gz trimmed_R2.fastq.gz를 실행하여 어댑터 제거 여부를 확인한다.
12. [어려움] 객관식

처리 전후 FastQC 결과 비교에 대한 해석으로 가장 적절한 것을 고르시오.

선택지 처리 후 Adapter Content가 높아져야 어댑터 제거가 성공한 것이다. FastQC는 처리 전후 비교에 사용할 수 없다. 처리 후 Adapter Content가 낮아졌다면 어댑터 제거가 효과적이었다고 볼 수 있다. Cutadapt 실행 후에는 품질 확인을 생략해야 한다.
주관식 1. [쉬움] 주관식 · Gemini 채점

압축된 R1.fastq.gz 파일 내용을 압축 해제한 상태로 확인하기 위한 명령어를 작성하시오.
주관식 2. [쉬움] 주관식 · Gemini 채점

R1.fastq.gz와 R2.fastq.gz를 동시에 FastQC로 분석하는 명령어를 작성하시오.
주관식 3. [보통] 주관식 · Gemini 채점

R1.fastq.gz와 R2.fastq.gz를 seq 1 2 형식의 for 루프로 FastQC 분석하는 명령어를 작성하시오.
주관식 4. [보통] 주관식 · Gemini 채점

Paired-end 파일에서 Illumina Universal Adapter 시작 서열 AGATCGGAAGAG를 제거하고 결과를 trimmed_R1.fastq.gz, trimmed_R2.fastq.gz로 저장하는 Cutadapt 명령어를 작성하시오.
주관식 5. [어려움] 주관식 · Gemini 채점

위 어댑터 제거에 품질 기반 트리밍 임계값 20을 함께 적용하고, 처리 후 FastQC를 다시 실행하는 명령어까지 작성하시오.
주관식 6. [어려움] 주관식 · Gemini 채점

FastQC 결과에서 Adapter Content가 높게 나왔을 때 품질 확인 → 전처리 → 재확인의 절차를 설명하시오.